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胶体金制备方法

发布时间:2023-11-22 11:48 |  点击次数:

 
 
免疫胶体金的制备

一 胶体金的制备和特性
(一)胶体金的结构
胶体金(colloidalgold)也称金溶胶(goldsol),是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核(原子金Au)及包围在外的双离子层构成,紧连在金核表面的是内层负离子(AuC12-),外层离子层H+则分散在胶体间溶液中,以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核,较小的胶体金颗粒基本是圆球形的,较大的胶体金颗粒(一般指大于30nm以上的)多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。

(二)胶体金的特性
1.胶体性质胶体金颗粒大小多在1~100nm,微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中,成为胶体金溶液。胶体金因而具有胶体的多种特性,特别是对电解质的敏感性。电解质能破坏胶体金颗粒的外周永水化层,从而打破胶体的稳定状态,使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒,而从液体中沉淀下来。某些蛋白质等大分子物质有保护胶体金、加强其稳定性的作用。
2.呈色性微小颗粒胶体呈红色,但不同大小的胶体呈色有一定的差别。最小的胶体金(2~5nm)是橙黄色的,中等大小的胶体金(10~20nm)是酒红色的,较大颗粒的胶体金(30~80nm)则是紫红色的。根据这一特点,用肉眼观察胶体金的颜色可粗略估计金颗粒的大小。
3.光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰,这个光吸收峰的波长(λmax)在510~550nm范围内,随胶体金颗粒大小而变化,大颗粒胶体金的λmax偏向长波长,反之,小颗粒胶体金的λmax则偏于短波长。

(三)胶体金的制备
1.制备方法胶体金的制备多采用还原法。氯金酸(HauC14)是主要还原材料,常用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢*化钠等。根据还原剂类型以及还原作用的强弱,可以制备0.8nm~150nm不等的胶体金。最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。具体操作方法如下:
(1)将HauC14先配制成0.01%水溶液,取100ml加热至沸。
(2)搅动下准确加入一定量的1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7•2H2O)水溶液。
(3)继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色,续而转成黑色,随后逐渐稳定成红色。全过程约2~3min。
(4)冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。
用此法可制备16~147nm粒径的胶体金。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。表1列举制备4种不同粒径胶体金时柠檬酸三钠的用量。

表1 四种粒径胶体金的制备及特性

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胶体金粒径(nm) 1%柠檬酸三钠加入量(ml)*胶体金特性 呈色 λmax

16 2.00 橙色 518nm
24.5 1.50 橙红 522nm
41 1.00 红色 525nm
71.5 0.70 紫色 535nm

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*还原100ml0.01%HauC14所需量

2.注意事项
(1)氯金酸易潮解,应干燥、避光保存。
(2)氯金酸对金属有强烈的腐蚀性,因此在配制氯金酸水溶液时,不应使用金属药匙称量氯金酸。
(3)用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水,或者是高质量的去离子水。
(4)是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的,用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的,硅化方法可用5%二氯甲硅*烷的氯*仿溶液浸泡数分钟,用蒸馏水冲净后干燥备用。
(5)胶体金的鉴定和保存:胶体金的制备并不难,但要制好高质量的胶体金却也并非易事。因此对每次制好的胶体金应加以检定,主要检查指标有颗粒大小,粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。

肉眼观察是最基本也是最简单和方便的检定方法,但需要一定的经验。良好的胶体金应该是清亮透明的,若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物,提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。在日光下仔细观察比较胶体金的颜色,可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。结制备的胶体金最好作电镜观察,并选一些代表性的作显微摄影,可以比较精确地测定胶体金的平均粒径。
胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存,加入少许防腐剂(如0.02%NaN3)可有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记,使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。

二、 免疫金的特性和制备

(一)免疫金的特性
胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合,在免疫组织化学技术中,习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质(抗原或抗体)结合,这类胶体金结合物常称为免疫金复合物,或简称免疫金(immunogold)。
胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚,一般认为是物理吸附性的。胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷,与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素,其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。

(二)免疫金的制备
1.用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。原则上可选择待标记蛋白质等电点,也可略为偏碱。但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。 在调节胶体金的pH值时应注意,胶体金会阻塞pH计的电极,不可直接将电极插入胶体金溶液中,宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇(PEG,20000)稳定胶体金后,再胶体金的pH值。
2.将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中,放置室温反应2~5min。由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附,并可使胶体金聚沉,因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度,应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐。
3.加入浓度为0.2%的PEG或BSA以饱和游离的胶体金。
4.离心分离,去除上清液中未结合的蛋白质。离心条件视胶体金颗粒的粒径而异:对5nm金颗粒可选用40000r/min离心1h;8nm金颗粒用25000r/min离心45min;14nm金颗粒用25000r/min离心30min,40nm金颗粒用15000r/min离心30min。
5.轻吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮,恢复原体积后再离心。如此洗涤2~4次。以彻底除去未结合的蛋白质。
6.免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液。

多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂,PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用:一为保护胶体金的稳定性,使之便于长期保存;二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择是十分重要的,不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。